大青叶中总黄酮及其抗氧化在超声波辅助提取的研究

      摘要：以大青叶（ＦｏｌｉｕｍＩｓａｔｉｄｉｓ）为原料，采用单因素试验法，研究了乙醇浓度、超声时间、料液比和提取次数等因素对大青叶中总黄酮提取率的影响，得到大青叶中总黄酮的适提取工艺条件为乙醇浓度７０％，超声时间３０ｍｉｎ，料液比（ｇ／ｍＬ）１∶２５和提取次数２次。该试验结果可为大青叶资源的进一步开发利用提供参考。

　　大青叶（Ｆｏｌｉｕｍｉｓａｔｉｄｉｓ）属于十字花科菘蓝属植物，是一种经济植物，在的中东部有较广泛的栽培［１，２］。大青叶是菘蓝的干燥叶，其地下部分为板蓝根。大青叶性寒、味苦、归心胃经，其主要活性成分有靛玉红、靛蓝、色胺酮、有机酸和黄酮类等［２－５］。作为一种传统中药，有清热解毒和凉血利咽等作用［６，７］。有研究表明，大青叶提取物不但能清除自由基、调理血脂，还具有抗病毒、抗菌和抗癌的功能［４－７］；同时有医学研究证明，大青叶中的黄酮类化合物使大青叶表现出了较高的抗氧化活性［７］，进一步提高了大青叶的利用价值。黄酮类化合物广泛存在于绿色植物体中，其生物活性一直受到国内外学者的广泛关注。该类化合物不但具有良好的抗氧化性能和清除自由基的能力，还在抗肿瘤、保护心血管和抗突变等方面表现出较的能力［８，９］。研究表明，天然黄酮类化合物是一类安全可靠、成本低、来源广、具有抗氧化活性的抗氧化剂［１０，１１］。目前，黄酮类化合物广泛应用于医药、食品和化妆品行业，正在逐步取代人工合成的抗氧化剂，有很好的应用前景。因此，开发廉价的天然黄酮类化合物势在必行［１２］。
　　超声波辅助萃取法是在普通萃取法基础上辅以超声波技术，利用超声波在超声过程中产生的空化效应、热效应、机械搅拌、化扩散、乳化作用等一系列效应，来加快萃取过程中的传质作用，从而提高萃取效率［１３］。本试验中，利用超声波辅助技术提取大青叶中的总黄酮，优化了提取条件，并应用Ｆｅｔｏｎ法［１４，１５］测定了总黄酮清除羟自由基（·ＯＨ）的能力，考察了黄酮的抗氧化性，旨在为大青叶中有效活性物质的提取提供理论基础，为进一步开发利用大青叶资源提供可靠的科学依据。
　　１材料与方法
　　１．１试验材料和药品
　　供试材料：河北本地产大青叶，２０１２年９月购买于河北省安国市中药批发市场。带回实验室后，置烘箱中６０℃下烘干，粉碎机粉碎，过４０目筛，储于棕色瓶，干燥避光保存，备用。
　　药品：芦丁标准品（生化试剂，药品生物制品检定所）、无水乙醇、９５％乙醇、３０％Ｈ２Ｏ２、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＮａＮＯ２、Ａｌ（ＮＯ３）３、ＮａＯＨ、水杨酸等，所用试剂均为分析纯及以上级别。试验所用水为去离子水。
　　仪器：７５６Ｐ型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），ＳＫ５２００Ｈ型超声波清洗仪（上海科导超声仪器厂），ＨＨ·ＳＹ１１－Ｎｉ２型电热恒温水浴锅（天津市中环实验电炉有限公司），ＡＧ２８５型分析天平（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ），ｐＨＳ－３Ｃ型酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司），ＰＨ０７０Ａ型干燥箱（上海一恒科技仪器有限公司），ＳＨＢ－３型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）。
　　１．２试验方法
　　１．２．１标准工作曲线的绘制准确吸取０．０５ｍｇ／ｍＬ芦丁标准品溶液０、１、２、３、４、５ｍＬ，分别置于６个１０ｍＬ容量瓶中（顺序编号１、２、３、４、５、６），各加入０．３ｍＬ５％ＮａＮＯ２溶液，６ｍｉｎ后，加０．３ｍＬ１０％Ａｌ（ＮＯ３）３溶液，６ｍｉｎ后，加入４ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液，３０％乙醇定容，静置１５ｍｉｎ，取４号瓶在２００～８００ｎｍ范围进行光谱扫描，得到标样的光谱图。从光谱图可知，在５０６ｎｍ处有大吸收峰，以芦丁标准溶液浓度为横坐标（ｘ），吸光度为纵坐标（ｙ）作标准曲线，得回归方程：ｙ＝１４．０６９ｘ＋０．０２２，Ｒ２＝０．９９８４。
　　１．２．２大青叶中总黄酮含量的测定称取一定量的大青叶粉末，加入一定量的溶剂，超声波提取。按照标准曲线的测定方法测定提取液的吸光度，根据回归方程计算大青叶中黄酮类化合物的含量。
　　1.2.3单因素试验分别考察了不同的乙醇浓度（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）、超声时间（１５、２０、２５、３０、３５ｍｉｎ）、料液比（ｇ／ｍＬ，下同）（１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０、１∶３５）和提取次数（１、２、３、４次）等因素对大青叶中总黄酮提取效果的影响，以确定大青叶总黄酮提取的工艺条件。
　　１．２．4体外抗氧化活性的测定采用Ｆｅｎｔｏｎ体系进行体外抗氧化活性测定。试验设３个组，即样品组、空白组、本底组。样品组中含有０．１５ｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４０．４ｍＬ，２ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸２．０ｍＬ，６ｍｍｏｌ／ＬＨ２Ｏ２１．０ｍＬ以及样液（稀释１０倍）１．０ｍＬ；空白组中用蒸馏水代替样液；本底组中以蒸馏水代替水杨酸。试验时，加入Ｈ２Ｏ２后，３７℃水浴１ｈ，１５００ｒ／ｍｉｎ离心６ｍｉｎ后取上清液，以蒸馏水为参比，分别测５１０ｎｍ处吸光度（Ａ）。按下式计算·ＯＨ清除率。
　　Ｅ＝｛［Ａ０－（Ａ－Ａ１）］／Ａ０｝×１００％
　　式中，Ｅ为清除率；Ａ０为空白组吸光度；Ａ为样品组的吸光度；Ａ１为本底组的吸光度。
　　２结果与分析
　　２．１乙醇浓度对大青叶总黄酮提取效果的影响
　　从图１可以看出，乙醇浓度在７０％以下时，随着乙醇浓度的提高，大青叶总黄酮的提取量呈增加的趋势，当乙醇浓度为７０％时，其提取量达到高，再增加乙醇浓度时，提取量反而减小，因此，确定大青叶总黄酮提取的适乙醇浓度为７０％。
　　２．２超声时间对大青叶总黄酮提取效果的影响
　　由图２可知，随着超声时间的增加，大青叶总黄酮提取量也随之增加，当超声时间为３０ｍｉｎ时，其提取量达到峰值，之后再增加超声时间，大青叶总黄酮提取量没有明显增加，因此确定其的超声时间为３０ｍｉｎ。
　　２．３不同料液比对大青叶总黄酮提取效果的影响
　　在乙醇浓度为７０％，超声时间３０ｍｉｎ的条件下，不同料液比对大青叶中总黄酮提取效果的影响如图３所示。由图３可见，随着溶剂比例的不断增加，大青叶总黄酮提取量不断增加，在料液比１∶２５时达到大，之后再增加溶剂比例，其提取量反而下降。因此，大青叶总黄酮提取的料液比以１∶２５为宜。
　　２．４提取次数对大青叶总黄酮提取效果的影响
　　由图４可知，随着提取次数的增加，大青叶总黄酮提取量不断增加，当提取次数为２次时，大青叶中的总黄酮已基本提取完全，再增加提取次数时其总黄酮含量无明显增加。因此确定的提取次数为２次。
　　２．５抗氧化性试验结果
　　由图５可见，大青叶总黄酮具有一定的清除羟自由基的能力，且其清除效果随提取液浓度的增加而增。
　　３小结与讨论
　　根据本试验结果可知，大青叶中含有一定量的总黄酮，具有较的抗氧化活性，是良好的天然抗氧化剂。试验结果表明，在超声波辅助提取的条件下大青叶中总黄酮的提取工艺条件为：乙醇浓度７０％，料液比１∶２５，超声时间３０ｍｉｎ，提取次数２次。
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